Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний



Способы обнаружения микроорганизмов

Принцип любой лабораторной диагностики инфекции состоит в определении прямыми или косвенными методами ее возбудителя (вируса, бактерии, гриба или простейшего) в тканях, биологических жидкостях или выделениях больного. Лаборатории занимаются не только диагностикой инфекции, но и определением чувствительности к антибиотикам. Основными микробиологическими методами остаются микроскопия, посев и выделение возбудителя в культуре клеток. Идентификация возбудителей проводится по фенотипическим признакам:

* бактерии- по способности ферментировать сахара;

* вирусы - по характеру цитопатического действия;

*грибы и простейшие - по морфологии.


МИКРОСКОПИЯ



Была и остается фундаментом микробиологии. Нередко она позволяет очень быстро получить ценные сведения.

Простейший метод - исследование нативного препарата. Его используют, например, для диагностики криптококкоза: спинно-мозговой жидкости тушью хорошо видны окруженные толстой капсулой дрожжевые клетки Cryptococcus neoformans. Микроскопию нативного препарата в темном поле применяют для поиска Treponema pallidum в определяемом из язв половых органов. Для диагностики дерматофитии прибегают к микроскопии волос и соскобов с кожи.

Окрашивание препаратов

Окраска по Граму

Окрашивание препаратов увеличивает чувствительность микроскопии, так как неокрашенные бактерии плохо различимы даже при увеличении в 400-1000 раз. Наиболее распространена дифференциальная окраска по Граму, хотя применяют и монохромные окраски.

Окраска по Граму позволяет отличить бактерии, чья толстая клеточная стенка практически полностью состоит из пептидогликана (грамположительные), от бактерий, чья клеточная стенка помимо пептидогликана имеет наружную мембрану, состоящую из липопротеидов и липополисахаридов (грамотрицательных). Основной краситель прочно фиксируется в стенке грамположительных бактерий, придавая им иссиня-черный цвет, и легко вымывается спиртом (или ацетоном) из стенки грамотрицательных бактерий, после чего они докрашиваются контрастным красителем в красный цвет.

Окраска по граму незаменима при исследовании мазков мокроты.

Например, при бактериальном вагинозе в мазке из влагалища видны эпителиальные клетки, усеянные грамположительными бактериями. Микроскопию мазков кала, окрашенных по Граму, используют как отборочное исследование. При обнаружении нейтрофилов приступают к бактериологическому исследованию и определению токсинов.

Окраска по Граму используют также для выявления бактерий и лейкоцитов в спинно-мозговой жидкости, синовиальной, плевральной и перитониальной жидкости.


Окраска по Цилю-Нильсену

Кислоустойчивыми называют бактерий, которые окрашиваются в красный цвет карболовым фуксином и не обесцвечиваются подкисленным этанолом. В качестве контрастного вещества используют метиленовый синий. Окраска по Цилю -Нильсену позволяет выявить микобактерии туберкулеза, Njcardia spp.и другие кислоустойчивые бактерии. По Цилю-Нильсену красят мазки мокроты, содержимого желудка, других биологических жидкостей, а также гистологические срезы.



Окраска флюорохромами

Окраску флюорохромами, например акридиновым оранжевым, применяют для выявления лейкоцитов, дрожжевых грибов и бактерий в биологических жидкостях. Используется для обнаружения микоплазмы в культуре клеток. Для идентификации микроорганизмов по морфологическим особенностям окрашивают их капсулы, жгутики и споры.


Иммунофлюоресцентное окрашивание

Метод прямой иммунофлюоресценции основан на связывании антител, меченных флюрохромом, с антигенами на поверхности или внутри микроорганизмов. Этот метод включает 2 этапа:

1 - объект обрабатывают антителами и антигенами, характерными для данного микроорганизма, а затем вторыми антителами, специфичными к первым

2- вторые антитела, меченные флюорохромом, связываются с первыми и выявляются под люминесцентным микроскопом.


Это метод принимают для обнаружения вирусов в культуре клеток (например, цитомегаловирус, вирус простого герпеса и другие), а также для обнаружения бактерий, с трудом поддающихся культивированию (например: легионелла).


Культивирование микроорганизмов


Сбор и транспортировка материала. Чтобы вырастить бактерий, грибов и вирусов в культуре, необходимо создать им подходящие условия.

Выделение патогенных бактерий. Для выделения патогенных бактерий из биологических материалов используют питательные среды, поддерживающие рост этих бактерий. В состав среды входит агар, который бактерии не метаболизируют, питательные вещества, необходимые для роста предполагаемого возбудителя,и часто - вещества, подавляющие рост посторонней микрофлоры. Для посева материалов, концентрация бактерий в которых невелика (перетониальная жидкость, спинно-мозговая жидкость), а также для культивирования анаэробных бактерий используют жидкие питательные среды на основе бульона.

Существуют 2 подхода к выделению бактерий:

1- используют для биологических материалов, которые в норме стерильны (кровь, СМЖ). Посев проводят на неселективные жидкие питательные среды: уже сам факт роста бактерий имеет диагностическое значение. Полученные на жидких средах бактериальные культуры пересевают на плотные среды и исследуют выросшие колонии.

2- используют при исследовании материалов, богатых нормальной микрофлорой (кал, мокрота, выделения из половых органов). Посев проводят на селективные среды, для чего к агару добавляют антибиотики или другие вещества, угнетающие рост всех микроорганизмов, кроме предполагаемых возбудителей.

Выделение вирусов. К культивированию вирусов обычно прибегают в тех случаях, когда инфекция не сопровождается повышением титра антител к вирусным антигенам или когда присутствие антител в сыворотке не являются диагностическими критериями. Цель культивирования - увеличение количества вируса до уровня, доступного определению. Методы культивирования различаются в деталях, но все они используют однослойные культуры клеток млекопитающих, в которых способен размножаться предполагаемый возбудитель. Вирус выявляют по его цитопатическому действию, либо определяют вирусные антигены путем иммунофлюоресцентного окрашивания.Культивирование особенно удобно для выявления быстро размножающихся вирусов.


Идентификация возбудителей


Выделенных бактерий обычно выявляют традиционными методами, то есть по их фенотипическим признакам. К таким признакам относятся размеры и форма колоний, выросших на плотных питательных средах, цвет, запах, морфологические особенности, способность к гемолизу, утилизации определенных субстратов (например, углеводов) и образованию определенных продуктов метаболизма.

Автоматическое фенотипирование. Применение автоматических бактериологических анализаторов позволяет быстро определить фенотип бактерий. Выделенная культура переносится в ячейки анализатора, содержащие различные субстраты, инкубируется, а затем спектр утилизации субстратов сравнивается с известными спектрами. Современные анализаторы оснащены системой распознавания, упрощения считывания результатов, производят расчеты вероятности того, что тот или иной микроорганизм окажется возбудителем.


Газо-жидкостная хроматография.

Этот метод применяют для определения конечных продуктов метаболизма бактерий, чаще всего - короткоцепочечных жирных кислот, образуемых облигатными анаэробами при угнетении глюкозы.


ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Быстрым и недорогим методом идентификации бактерий, экзотоксинов и вирусов по их белковым и полисахаридным антигенам являются латекс-агглютинации и ИФА.

Прямая агглютинация - простой, но малочувствительный метод.

Поверхностные антигены бактериальных клеток (капсульные полисахариды) легко обнаруживаются в реакции агглютинации при добавлении антител к взвеси бактерий. Этот метод применяют для определения видовой принадлежности шигеллы, сальмонеллы. При ИФА обычно используют высокоспецифические моноклональные антитела. В данном случае фермент выполняет роль усилителя биологического сигнала, поэтому ИФА высокочувствителен. Методы основаны на выявлении антигенов с помощью антител, отличаются друг от друга лишь способом улавливания биологического сигнала. К сожалению, большинство из них не количественные, а качественные.


Олигонуклеотидные зонды (метод ПЦР)

Широко применяется в диагностике бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных инфекций. В основе метода лежит выявление специфических участков ДНК и РНК данного микроорганизма. Зонд представляет собой короткий фрагмент ДНК с уникальной последовательностью нуклеотидов, меченный хромогеном, изотопом или другим сигналом. Если нуклеотидные последовательности зонда и одноцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарны, происходит их связывание друг с другом (гибридизация). Исследуемые микроорганизмы не обязательно должны быть живыми, поэтому метод особенно ценен для идентификации возбудителей, не поддающихся культивированию.

Прямое определение.

В продаже имеются олигонуклеотидные зонды для прямого определения в материале, полученном от больного, целого ряда патогенных микроорганизмов, в том числе легионеллы, хламидии, гонореи, гарднереллы, пиогенного стрептококка, кандиды, вируса папилломы человека, трихомонады, микобактерии и сальмонеллы и другие.

Аплификация. Теоретически можно получить любое количество копий нужного фрагмента нуклеиновой кислоты. Метод ПЦР заключается в чередовании циклов гибридизации одноцепочечных ДНК или РНК с мечеными олигонуклеотидными зондами (праймерами), синтеза комплементарной нуклеотидной последовательности с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и денатурации образовавшихся двухцепочечных структур путем нагревания. За 20-30 циклов количество копий нужного фрагмента нуклеиновой кислоты достигает некоторых миллионов.


Определение чувствительности возбудителя к антибиотикам.



Существуют качественные и количественные методы. Качественные методы позволяют отнести возбудителя к одной из 3 категорий микроорганизмов: чувствительным, умеренно устойчивым или устойчивым. Обычно используют метод диффузии в агаре в модификации Кирби- Бауэра: пропитанные антибиотиками бумажные диски укладывают на поверхность плотной питательной среды, засеянной исследуемым штаммом, и через 18-20 ч измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков. Другой способ - посев исследуемой бактериальной культуры в пробирке с жидкими питательными средами, в каждую из которых добавлен какой-либо антибиотик в определенной концентрации.

Для количественного определения используют метод последовательных разведений. Взвесь бактерий высевают на жидкие и плотные питательные среды, содержащие возрастающие концентрации антибиотика. О чувствительности бактерий судят по минимальной концентрации антибиотика, подавляющей их рост, - минимальная подавляющая концентрация (МПК). Содержание пробирок (чашек Петри), в которых бактериального роста не было, пересевают на свежие питательные среды. Концентрация антибиотика в пробирке, из которой получить субкультуру не удалось, является минимальной бактерицидной - минимальная бактерицидная культура (МБК).

Более удобный вариант метода диффузии в агаре - Е-тест. Вместо бумажных дисков в нем используют градуированные полоски, на которых создан градиент концентрации антибиотика. Полоски укладывают на поверхность плотной питательной среды, засеянной исследуемым штаммом; после инкубации образуется овальная зона подавления роста. В месте пересечения этой зоны с полоской считывают значения МПК.


Имеются противопоказания необходима консультация специалиста.


#анализыистра#сдатьпосев#исследованиянаинфекции#бакпосеввистре#недорого#посевмочи#лабораторияKDL#гоистра#истринскийрайон#анализынедорого

5 просмотров0 комментариев

Недавние посты

Смотреть все